超低温保存中的氧化应激和细胞凋亡

G家自然科学基金(批准号: 30972411)资助的课题
*通讯作者。Tel: 010-62336062, E-mail: chbly@sohu.com
Received: November 3, 2012   Accepted: January 5, 2013
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.30972411)
*Corresponding author. Tel: +86-10-62336062, E-mail: chbly@sohu.com
 
 
超低温保存(cryopreservation)是指将生物材料活体, 采取一定的技术, 存入–80 ℃以下的低温保存(通常为液氮–196 ℃), 需要时采取一定的方法使之回到常温并正常生长的一整套生物技术。由于在医学、农业、畜牧业及食品等相关*域有着广泛的应用前景, 超低温保存已成为近年来低温生物学的研究热点之一^[1]。近年来, 超低温保存的技术研究已趋于成熟, 除了基于低温脱水的传统的超低温保存技术外, 新兴的基于细胞内部溶质玻璃化的超低温保存技术的发展, 极大地扩充了超低温保存的应用范围^[2]。超低温保存技术的发展依赖于其机制的解答, 而机制的解答也会起到指导超低温保存技术发展的作用。但是, 就目前的现状而言, 超低温保存的机制研究相对滞后, 这也在一定程度上限制了超低温保存技术应用范围的进一步扩大。
近年来的研究发现, 在超低温保存中往往伴随着氧化应激和细胞凋亡两大生理现象, 这些现象是否与超低温保存密切相关, 是否会影响超低温保存的效果, 是否可以作为改进超低温保存技术的依据, 这些问题也逐渐得到了研究者的关注。本文对近二十年来超低温保存中与氧化应激和细胞凋亡两大生理现象相关的研究做出综述, 以期为推进超低温保存技术的进步提供理论依据。

1 超低温保存中的氧化应激现象

氧化应激是指由于活性氧(reactive oxygen species, ROS)过度产生和抗氧化防御机制减弱, 导致活性氧的生成和清除之间的平衡失调, 过量的活性氧引起分子、细胞和机体的损伤^[3-7]。诸多的研究发现, 超低温保存往往伴随着生物材料中活性氧水平的升高, 而过多的活性氧引起的氧化应激是导致生物材料超低温保存损伤的重要原因之一。理论表明, 当活性氧的生成量大于细胞的抗氧化防御系统水平时, 过多的活性氧就会攻击脂质、蛋白质或核酸等大分子, 通过去除电子的方式, 促使其结构的修改和功能的改变, 从而导致脂质的过氧化、蛋白质的变性以及DNA或 RNA的损伤^[8-10]。
Baumber^[11]对马精子的超低温保存研究发现, 高水平活性氧的生成会增加DNA的片段化和减少谷胱甘肽的生成量, 并认为活性氧可能与精子获能的信号通路相关。这与Meseguer等^[12]的发现存在一定的一致性——谷胱甘肽过氧化物酶1和4的表达水平及活性、谷胱甘肽浓度与人类精子超低温保存后的恢复速率相关,。Li等^[13]同样在人类精子的超低温保存中发现, 保存后活性氧的生成量显著上升, 并且与冻融后精子的生存力和运动性下降等变化呈现出相关性, 因此认为超低温保存后精子质量的下降可能是由氧化应激所造成的。Zribi等^[14]在人类精子的超低温保存中也发现了保存后精子的DNA片段化和氧化率显著增加的现象, 但并未对其产生机制做出解释。Thomson等^[15]以8-羟化脱氧鸟苷(8-OHdG)作为生物标记, 证明了超低温保存引起的人类精子DNA片段化与氧化应激相关。
生物材料中活性氧的种类包括了激活的单电子氧(¹O₂)、超氧阴离子自由基(·O₂^–)、过氧化氢(H₂O₂)和羟基自由基(·OH)等^[16]。目前的研究显示, 与超低温保存相关的氧化应激可能是由羟基自由基所主导的。Fang等^[16]在研究中发现, 超低温保存后伴随着可可体细胞胚的恢复, 羟基自由基产生的挥发性碳氢化合物——甲烷, 呈现出一定的周期性变化规律。更确凿的证据来自于Góes等^[10]的研究, 他们将超低温保存后的山羊精子培养在4种不同的活性氧诱导机制下(分别产生激活的单电子氧、超氧阴离子自由基、过氧化氢和羟基自由基), 精子对羟基自由基显示出了高敏感性。
为了减少或消除氧化应激的影响, 抗氧化剂在超低温保存中得到了广泛的应用。抗氧化剂可以转换活性氧, 防止其过剩, 从而**大限度地提高超低温保存后细胞的存活率^[17]。在众多的抗氧化剂中, 过氧化氢酶经常作为冷冻和熔融过程中的添加剂使用。研究表明, 添加过氧化氢酶可以显著减少超低温保存后人类精子^[13]和马精子^[11]的活性氧的生成量, 提高家猫精子的运动性和前向性^[8], 并改善人类造血干细胞的粘附性和与迁移有关的属性等^[18]。此外, 过氧化物歧化酶^[8]、依达拉奉^[19]、维他命E、维他命C、谷胱甘肽、硫辛酸、甜菜碱^[9]、抗坏血酸^[13]、蛋氨酸、肌醇、肉碱^[20]等物质也被作为抗氧化剂应用于超低温保存中。**新的研究还显示, 精浆对于解冻后马精子^[11]和山羊精子^[10]的恢复更为有效: 而血小板裂解物对超低温保存后人类肝脏细胞代谢功能的恢复更为有效^[21]。这可能同样是与精浆和血小板裂解物中含有抗氧化性的物质相关。
此外, 针对细胞膜的研究显示, 超低温保存会造成细胞膜的大范围破坏, 因此往往将细胞膜的完整性作为成功的超低温保存的**低标准^[22]。如前所述, 氧化应激是造成超低温保存中生物材料损伤的重要原因之一。活性氧很容易氧化膜脂上的不饱和脂肪酸。脂质的过氧化一方面改变了细胞膜的结构和功能, 例如通透性的升高, 另一方面它会导致二次脂质过氧化产物如醛的生成, 而醛分解后的丙二醛(MDA)又会与蛋白质、酶类和DNA链接, 进一步导致潜在的诱变^{[9, 16, 17]}。
Martinez等^[23]在甘蔗胚性愈伤组织超低温保存后的第2天观察到了电导率的升高。尚晓倩^[24]在芍药花粉的超低温保存中观察到电导率随保存时间延长持续上升: 而李广清^[25]在山茶花粉的超低温保存中发现花粉电导率是前期升高, 后期有出现下降趋势, 但仍高于对照。这些研究都说明超低温保存确实在一定程度上对细胞膜造成了损伤, 从而导致了细胞外电解质渗透液的增加。除了使用电导率作为细胞膜通透性的参数外, 脂质过氧化的产物丙二醛(MDA)也被用来作为检验超低温保存效果的指标。超低温保存后, 山茶花粉^[25]、蜡梅花粉^[26]、木薯茎尖^[27]、罗氏沼虾胚胎^[28]、留兰香茎尖^[29]等的MDA含量均显著升高。超低温保存中氧化应激及外源抗氧化剂关系的研究进展见图1。
 
图1  超低温保存中氧化应激及外源抗氧化剂作用
Fig.1  Effect of antioxidants to the pro-oxidant/antioxidant balance in the cryopreservation
 
除了以上脂质过氧化的间接证据外, 研究者还证明了超低温保存对细胞膜脂类成分变化的直接影响。Blesbois等^[30]发现超低温保存导致火鸡和珍珠鸡精子的细胞膜胆固醇/磷脂的比例显著下降, 并认为这种变化降低了细胞膜的流动性。Chakrabarty等^[31]在山羊精子的超低温保存中发现, 总脂及其组成成分的中性脂肪、糖脂和磷脂在超低温保存后下降明显, 其中与磷脂相关的不饱和脂肪酸比例变小, 而饱和脂肪酸比例上升, 因而认为山羊精子应对超低温损伤的主要机制是通过优先脱落细胞膜中亲水性的脂质成分而增加细胞膜的疏水性进行的。Odintsova等^[32]对海洋无脊椎动物幼虫细胞的研究显示, 超低温保存极大地影响了细胞膜脂肪酸的饱和度、单烯度和多烯度, 并且这种变化因保存的细胞来源和使用的冷冻保护剂而存在差异。
鉴于以上研究, 相应的细胞膜保护措施也被应用于超低温保存中, 其中通过一定的方式来增加胆固醇和不饱和脂肪酸的含量是采取的主要方式。已证明, 外援胆固醇的添加可以显著改善牛精子^[33]和马精子^[34]超低温保存后的存活率: 而Ω-3脂肪酸可以显著提高超低温保存后不饱和脂肪酸的含量^[35]。此外, 还有研究发现, 蔗糖的预培养可以使香蕉悬浮细胞超低温保存后豆甾醇/甾醇的比例, 总脂肪酸中的中性脂质、糖脂和鞘脂的成分以及游离脂肪酸酸含量显著增高, 并使中性脂肪的双键指数增加以及糖脂和鞘脂、磷脂和游离脂肪酸的双键的减少, 并提高了超低温保存后的存活率^[36]。而利用毛猴素进行化学去脂, 可以显著提高猫胚胎超低温保存后的存活率、桑椹胚和胚泡的形成率^[37]。这些保护措施可能都与改变细胞膜脂类成分的含量相关。

2 超低温保存中的细胞凋亡现象

超低温保存造成的细胞死亡主要有以下三种类型: 细胞破裂(与冰晶生成有关)、细胞坏死和细胞凋亡^[38]。部分研究发现, 超低温保存造成的细胞死亡具有迟发性, 进一步研究迟发性死亡的背后机制显示, 这种死亡主要是由细胞坏死和细胞凋亡这两种途径所造成的^[39]。其中, 区别于细胞坏死的被动过程, 细胞凋亡作为一种与能量相关的, 由基因控制的细胞**、有序的死亡方式, 得到了超低温保存机制研究者的广泛关注。
细胞凋亡通常会采用半胱氨酸蛋白酶活力、磷脂酰丝氨酸的外化、线粒体膜电位的改变和DNA片段化等参数进行检测^[40]。Paasch等^[41]比较了超低温保存对人类精子细胞凋亡参数的影响, 发现超低温保存后, 半胱氨酸蛋白酶-3、-8和-9的活性显著上升, 线粒体膜电位下降, 但DNA片段不存在显著变化。Martin等^[42-43]同样在超低温保存后的牛精子中发现线粒体膜电位的降低、半胱氨酸蛋白酶活性和细胞膜通透性升高等现象, 并检测到了细胞色素C和凋亡诱导因子这两种伴随细胞凋亡的蛋白的产生, 但没有发现DNA片段化和细胞核浓缩的显著变化。Vogel^[44]通过免疫印迹技术比较了人类真皮的成纤维细胞中线粒体蛋白质Bcl-XL和Bax的比值(这两种蛋白的比值代表了细胞凋亡正向和负向的比例), 发现在超低温保存复温后比值略有升高, 在之后的6小时和12小时显著上升, 直到24小时才恢复到与对照相当的水平。Liu等^[45]在比较超低温保存前后的小鼠卵巢卵泡的基因组时, 发现超低温保存诱导了凋亡基因Fas和Fas配体的表达。Park等^[46]同样证明了冻融过程引起了牛囊胚细胞中与凋亡相关的生存素、Fas、热休克蛋白70和半胱氨酸蛋白酶-3基因表达量的增加。
以上研究在证明超低温保存与细胞凋亡的相关性之外, 也为如何减轻或消除细胞凋亡的影响指明了道路。半胱氨酸蛋白酶抑制剂已被证明在猪肝细胞超低温保存中降低了半胱氨酸蛋白酶-3的活性、减少线粒体中细胞色素C的释放, 减慢线粒体膜电位的下降速度, 并使肝细胞活力的功能指标——白蛋白产量、地西泮的代谢和尿素产量显著增加^[47]。而在大鼠的肝细胞超低温保存中, 添加半胱氨酸蛋白酶抑制剂则显著改善了复温后6小时和24小时的肝细胞的分化能力和功能^[48]。
氧化应激和细胞凋亡作为近年来超低温保存中生理现象的两大研究热点, 其本身也存在着千丝万缕的联系。研究表明, 超低温保存中出现的氧化应激不仅可以直接造成细胞损伤, 也可能诱导了细胞凋亡, 如活性氧活化核转录因子NF-KB(nuclear factor-Kappa B, NF-kB), 导致细胞凋亡; 或通过作用于线粒体介导细胞凋亡; 活性氧导致DNA损伤, 激活P53, 诱导细胞凋亡以及ROS激活SAPK通路介导细胞凋亡等^[49]。
图2所示线粒体产生的活性氧介导的细胞凋亡, 可以在一定程度上反映超低温保存中细胞凋亡与氧化应激的关系。
 
图2  由线粒体产生的活性氧介导的细胞凋亡示意图(根据参考文献[50]修改)
Fig.2   Schematic representation of apoptosis which is mediated by ROS generated by mitochondria(modified from reference [50])

3 结语和展望

超低温保存中有关氧化应激和细胞凋亡两大生理现象的研究还处于起步阶段, 本质的揭示尚需要大量的实验支持。对超低温保存中氧化应激和细胞凋亡这两大生理现象广泛和深入研究, 不仅对揭示超低温保存机制有重要的理论意义, 也将为超低温保存技术发展提供一条新的思路。
围绕该研究方向, 未来的超低温保存研究将集中在超低温保存技术中探索更多的抗氧化剂(包括酶类和非酶类)的使用效果, 从而开发新型的保护剂; 超低温保存的技术策略也会更多通过防止细胞膜氧化, 而不是仅仅关注冰晶对细胞膜的伤害展开; 超低温引起细胞凋亡的信号途径及其阻断技术也会得到深入的研究, 从而提高超低温保存材料的成活率。
 
 

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